Hochleistungschromatographie (HPLC)

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Analysetechnik, die Komponenten in einer Mischung trennt, identifiziert und quantifiziert. Es arbeitet nach den Prinzipien der Flüssig-Fest- oder Flüssig-Flüssig-Chromatographie, bei der eine flüssige mobile Phase die Probe durch eine stationäre Phase transportiert, was zu einer Trennung der Komponenten auf der Grundlage ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften führt.

HPLC-Systeme bestehen typischerweise aus mehreren Schlüsselkomponenten. Die mobile Phase, bei der es sich um ein Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelgemisch handelt, wird von einer Hochdruckpumpe mit kontrollierter Flussrate gefördert. Die Probe wird mit einem Autosampler oder einem manuellen Injektor injiziert und dort in die mobile Phase eingeführt. Anschließend passieren die mobile Phase und die Probe eine mit der stationären Phase gefüllte Säule.

Die Säule ist ein Schlüsselelement in der HPLC und kann je nach gewünschtem Trennmechanismus mit einer Vielzahl stationärer Phasen gefüllt werden. Die stationäre Phase kann auf Kieselsäure oder Polymer basieren oder mit funktionellen Gruppen verbunden sein, um die gewünschten Trenneigenschaften zu erreichen.

Der Nachweis in der HPLC erfolgt mithilfe verschiedener Techniken, einschließlich UV-Vis-Absorption, Fluoreszenz, elektrochemischer oder Massenspektrometrie. Die eluierenden Komponenten werden anhand ihrer spezifischen physikalisch-chemischen Eigenschaften und Reaktionen erkannt und quantifiziert.

Die Datenerfassung und -analyse erfolgt über ein spezielles Softwaresystem, das das Instrument steuert, Daten vom Detektor sammelt und diese zur Peakidentifizierung, Quantifizierung und Analyse in Chromatogramme verarbeitet.

HPLC umfasst mehrere Arten, jede mit ihrem eigenen Trennmechanismus und ihrer eigenen Anwendung:

  • Umkehrphasenchromatographie

    Bei der Umkehrphasen-HPLC werden eine unpolare stationäre Phase (typischerweise auf Kieselsäure oder Polymerbasis mit hydrophoben Funktionalitäten) und eine polare mobile Phase (wässriges oder organisches Lösungsmittel) verwendet. Unpolare Analyten eluieren schneller, während polare Analyten später eluieren. Dieser Modus wird häufig zur Trennung kleiner organischer Moleküle, pharmazeutischer Verbindungen und hydrophober Biomoleküle verwendet.

  • Normalphasenchromatographie

    Bei der Normalphasen-HPLC werden eine polare stationäre Phase (Siliciumdioxid oder andere polare Medien) und eine unpolare mobile Phase (organische Lösungsmittel) verwendet. Polare Analyten eluieren aufgrund stärkerer Wechselwirkungen mit der stationären Phase schneller. Diese Technik eignet sich zur Trennung hochpolarer Verbindungen wie Zucker, organische Säuren und einige Naturprodukte.

  • Ionenaustauschchromatographie

    Bei der Ionenaustausch-HPLC wird eine stationäre Phase mit ionisierbaren Gruppen verwendet, beispielsweise positiv oder negativ geladene Harze. Die Analyten werden anhand ihrer Ladungseigenschaften getrennt, wobei entgegengesetzt geladene Analyten von der entgegengesetzt geladenen stationären Phase angezogen werden. Diese Technik wird zur Analyse geladener Biomoleküle wie Proteine, Peptide und Nukleinsäuren eingesetzt.

  • Größenausschlusschromatographie (SEC)

    SEC, auch Gelfiltrationschromatographie genannt, trennt Analyten anhand ihrer Größe oder ihres Molekulargewichts. Es verwendet eine poröse stationäre Phase, die es kleineren Molekülen ermöglicht, in die Poren einzudringen, was zu einer längeren Verweilzeit führt, während größere Moleküle die Säule schneller passieren. SEC wird üblicherweise zur Trennung von Biomolekülen, Polymeren und Nanopartikeln verwendet.

  • Affinitätschromatographie

    Die Affinitätschromatographie nutzt spezifische Wechselwirkungen zwischen einem Zielanalyten und einem auf der stationären Phase immobilisierten Liganden. Es bietet hochselektive Trennungen und ermöglicht die Isolierung und Reinigung spezifischer Biomoleküle wie Antikörper, Enzyme und Rezeptoren. Die stationäre Phase kann so angepasst werden, dass sie mit dem Zielmolekül interagiert und so eine effiziente Trennung und Reinigung ermöglicht.

Branchen, die HPLC verwenden

HPLC findet aufgrund seiner Vielseitigkeit und Analysefähigkeiten in verschiedenen Branchen Anwendung. Zu den Branchen, die HPLC üblicherweise nutzen, gehören:
  • Arzneimittel

    HPLC spielt eine wichtige Rolle in der pharmazeutischen Analyse und liefert genaue und zuverlässige Daten für die Arzneimittelentwicklung, Qualitätskontrolle und Formulierung. Es ermöglicht die Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Arzneimittelverbindungen und Verunreinigungen. HPLC-Techniken wie Umkehrphasenchromatographie, Größenausschlusschromatographie und Ionenaustauschchromatographie werden zur Analyse der Reinheit, Stabilität, Auflösung und Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln eingesetzt.

  • Umwelttests

    HPLC wird häufig in der Umweltanalyse eingesetzt, um Schadstoffe, Pestizide, Herbizide und Kontaminanten in verschiedenen Matrizen wie Boden, Wasser, Luft und Lebensmitteln zu erkennen und zu quantifizieren. Es hilft bei der Bewertung der Umweltauswirkungen, der Überwachung der Einhaltung gesetzlicher Standards und der Bewertung der Effizienz von Sanierungsprozessen. HPLC-Techniken wie Umkehrphasen-, Normalphasen- und Ionenaustauschchromatographie helfen bei der Analyse komplexer Umweltproben.

  • Nahrungsmittel-und Getränkeindustrie

    HPLC wird in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie zur Qualitätskontrolle, Echtheitsprüfung und Analyse von Zusatzstoffen, Verunreinigungen, Vitaminen, Aromen und Konservierungsstoffen eingesetzt. Es trägt dazu bei, die Einhaltung von Lebensmittelsicherheitsvorschriften sicherzustellen und die Angaben auf der Produktkennzeichnung zu überprüfen. HPLC-Techniken wie Umkehrphasen- und Ionenaustauschchromatographie werden zur genauen Analyse von Lebensmittel- und Getränkeproben eingesetzt.

  • Forensik

    HPLC ist in forensischen Laboren für die Analyse von Drogen, toxikologische Untersuchungen, die Identifizierung kontrollierter Substanzen und die Messung des Blutalkoholspiegels unverzichtbar. Es ermöglicht die genaue Identifizierung und Quantifizierung von Arzneimitteln und Metaboliten in biologischen Proben. Für die forensische Analyse werden HPLC-Techniken wie Umkehrphasenchromatographie, Festphasenextraktion und chirale Chromatographie eingesetzt.

  • Chemieindustrie

    HPLC wird in der chemischen Industrie zur Analyse und Charakterisierung chemischer Verbindungen, Polymere und Zwischenprodukte eingesetzt. Es hilft bei der Qualitätskontrolle, Prozessoptimierung und Identifizierung von Verunreinigungen oder Reaktionsnebenprodukten. HPLC-Techniken wie Umkehrphasen-, Normalphasen- und Größenausschlusschromatographie werden häufig in der chemischen Analyse eingesetzt.

  • Biotechnologie und Biowissenschaften

    HPLC wird in der biotechnologischen und biowissenschaftlichen Forschung häufig zur Analyse von Biomolekülen wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten und Metaboliten eingesetzt. Es hilft bei der Reinigung, Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinen. Für die Biomolekülanalyse werden HPLC-Techniken wie Umkehrphasen-, Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie eingesetzt.

  • Kosmetik- und Körperpflegeprodukte

    HPLC wird bei der Analyse von kosmetischen Inhaltsstoffen, Konservierungsstoffen, Duftstoffen und Wirkstoffen in Körperpflegeprodukten eingesetzt. Es gewährleistet Produktsicherheit, Qualität und die Einhaltung gesetzlicher Anforderungen. Für die kosmetische Analyse werden HPLC-Techniken wie Umkehrphasen- und Normalphasenchromatographie eingesetzt.